凍干保護(hù)劑是除賦形劑外，給于藥物有效成分在凍干機(jī)冷凍干燥過(guò)程及凍干后儲(chǔ)存階段保護(hù)藥物藥效的成分。常用保護(hù)劑有糖類、白蛋白、聚乙二醇等等。凍干保護(hù)劑可影響生物制品的質(zhì)量、效價(jià)和穩(wěn)定性，改變生物制品的生產(chǎn)工藝，提高產(chǎn)品干燥能力并增大產(chǎn)品批次間的穩(wěn)定性。耐熱凍干保護(hù)劑有免疫活性但無(wú)藥理活性，可在凍干和保存時(shí)維持疫苗的穩(wěn)定性，初次干燥時(shí)在適宜的溫度下疫苗不倒塌，企業(yè)低成本即可獲取。
　　
　　一、分類
　　
　　(一)按相對(duì)分子量分按相對(duì)分子量分可分為低分子化合物和高分子化合物。
　　
　　1.低分子化合物低分子化合物可提高微生物存活率，形成均一懸液，起到水分緩解作用。如：酸性物質(zhì)：谷氨酸、天冬氨酸、乳酸；中性物質(zhì)：葡萄糖、乳糖、蔗糖、海藻糖、山梨醇；堿性物質(zhì)：精氨酸、組氨酸。
　　
　　2.高分子化合物高分子化合物對(duì)微生物有保護(hù)作用，可促進(jìn)其升華形成耐熱骨架阻斷熱傳導(dǎo)和熱輻射。如：白蛋白、明膠、蛋白胨、脫脂奶粉。水解明膠水解明膠可去掉雜質(zhì)蛋白、無(wú)抗原性、無(wú)過(guò)敏反應(yīng)、無(wú)熱源，并且分子量小、均質(zhì)、易溶于水，可過(guò)濾除菌，共熔點(diǎn)為-12℃。對(duì)微生物的保護(hù)作用高出普通明膠10％以上。脫脂奶粉可促進(jìn)升華、加熱滅菌，易取得均質(zhì)產(chǎn)品，并擴(kuò)大細(xì)胞相互間的距離。
　　
　　(二)按功能和性質(zhì)分1.耐熱凍干保護(hù)劑耐熱凍干保護(hù)劑在凍結(jié)和干燥過(guò)程中，可防止活性組分變性，如海藻糖、蔗糖、聚維酮（PVP）等。2.填充劑可防止有效組分隨水蒸氣一起升華逸散，如：甘露醇、明膠等。3.抗氧化劑產(chǎn)品的自身氧化可消耗凍干樣品內(nèi)部和環(huán)境中的氧；放入電子或氫離子，可阻斷凍干樣品中氧化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，抑制氧化酶活性，防止樣品在冷凍干燥及儲(chǔ)藏過(guò)程中氧化變質(zhì)。如硫代硫酸鈉、維生素E、維生素C等。4.酸堿調(diào)整劑在冷凍干燥、儲(chǔ)藏過(guò)程中，將生物制品PH值調(diào)整到活性物質(zhì)zui穩(wěn)定區(qū)域。常用的有：磷酸二氫鉀、磷酸氫鈉。
　　
　　(三)按物質(zhì)的種類分
　　
　　1.糖/多元醇類單糖（葡萄糖、半乳糖）：糖與生物制品活性組分的分子形成氫鍵而代替了原有水的位置，起保護(hù)作用；低聚糖（蔗糖、海藻糖）：低聚糖能起到低溫保護(hù)功能和脫水保護(hù)作用；海藻糖則具有相對(duì)較高的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度。海藻糖—蛋白質(zhì)—水微冰晶的形成，有效防止了水對(duì)玻璃化態(tài)的增塑作用。并且其內(nèi)部氫鍵較少，有利于蛋白質(zhì)分子間形成氫鍵。多元醇（甘露醇、山梨醇、丙三醇）:多元醇具有和糖一樣的作用。甘露醇無(wú)菌濾液穩(wěn)定，不易被氧化，可提供支持結(jié)構(gòu)，并且不與活性組分發(fā)生反應(yīng)；山梨醇是甘露醇的同分異構(gòu)體，但其溶解度比甘露醇大，在常溫下呈粘稠的透明狀液體，有旋光性，略有甜味，具有吸濕性，高溫下不穩(wěn)定，在冷凍干燥配方中，山梨醇常用作填充劑。
　　
　　2.表面活性劑類表面活性劑是降低界面的張力，親水、親油基組成的化合物。表面活性劑可分為離子型、非離子型。凡是溶于水能電離成離子的，稱為離子型表面活性劑，否則稱為非離子型表面活性劑。表面活性劑在凍結(jié)和脫水過(guò)程中既能降低冰、水界面張力所引起的凍結(jié)和脫水變形，又能在復(fù)水過(guò)程中對(duì)活性組分起到潤(rùn)濕劑作用。但在凍干生物制品測(cè)定和長(zhǎng)期儲(chǔ)藏中，表面活性劑并沒(méi)有保護(hù)作用。
　　
　　3.氨基酸類氨基酸是蛋白質(zhì)的基本構(gòu)成單位，其中zui主要的是a-氨基酸。常用的氨基酸類保護(hù)劑有甘氨酸、谷氨酸、精氨酸和組氨酸，試驗(yàn)表明氨基酸是的填充劑。低濃度甘氨酸可通過(guò)抑制10或100mmol/L磷酸緩沖鹽結(jié)晶所致PH值的改變而阻止蛋白質(zhì)藥物變性，并且能升高成品的塌陷（崩解）溫度，阻止因塌陷而引起的蛋白質(zhì)藥物的破壞。
　　
　　4.其它添加劑類其它添加劑類保護(hù)劑包括抗氧化劑、緩沖劑和凍干加速劑?？寡趸瘎阂环N是抗氧化劑的自身氧化，消耗凍干樣品內(nèi)部和環(huán)境中的氧，使凍干樣品物料不被氧化；另一種使抗氧化劑給出電子或氫離子，阻斷凍干樣品中的氧化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；還有一種方式是抗氧化劑通過(guò)抑制氧化的活性而防止凍干樣品的氧化變質(zhì)，如維生素E、維生素C、硫代硫酸鈉、硫脲。緩沖劑：蛋白質(zhì)具有兩性電解質(zhì)，既能和酸作用又能和堿作用。在中性環(huán)境中，大多數(shù)蛋白質(zhì)是穩(wěn)定的，由于蛋白質(zhì)溶液在凍結(jié)過(guò)程中溶液的濃度是逐漸升高的，所以在高濃度時(shí)可改變?nèi)芤旱腜H值，PH值變化4個(gè)單位導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，使生物制品失活。因此在凍干保護(hù)劑配方中，需添加適量緩沖劑。如，磷酸二氫鉀、磷酸二氫鈉。凍干加速劑：冷凍干燥過(guò)程耗時(shí)長(zhǎng)、耗能多，迫切需要對(duì)凍干循環(huán)進(jìn)行優(yōu)化，降低生產(chǎn)成本。叔丁醇是一種小分子醇，與水*互溶，具有低毒性、高蒸汽壓。在藥品水溶液中加入叔丁醇能起到以下作用：可降低干燥層阻力，從而加速干燥過(guò)程，縮短干燥時(shí)間；對(duì)于難溶于水的藥品，可使產(chǎn)品具有較高的比表面積、好的外觀，并易于復(fù)水，提高藥品溶液和凍干品的穩(wěn)定性，且有一定的抑菌作用。
　　
　　二、凍干保護(hù)劑的作用機(jī)理
　　
　　(一)凍結(jié)過(guò)程中低溫保護(hù)機(jī)理“優(yōu)先作用”機(jī)理認(rèn)為，蛋白質(zhì)溶液在達(dá)到zui大凍結(jié)濃度之前，優(yōu)先與水作用（優(yōu)先水合），而保護(hù)劑優(yōu)先被排斥在蛋白質(zhì)區(qū)域外（優(yōu)先排斥）。這是由于保護(hù)劑的加入，增大了水分子的表面張力，促使了蛋白質(zhì)分子優(yōu)先與水分子相互作用。在這種情況下，蛋白質(zhì)分子外表面比其體相中有相對(duì)較多的水分子和相對(duì)較少的保護(hù)劑分子，從而也就保護(hù)了蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象。“優(yōu)先作用”機(jī)理并不能*解釋用聚合物或蛋白質(zhì)自身在高濃度時(shí)保護(hù)蛋白質(zhì)的現(xiàn)象。因此，必然存在其他保護(hù)作用機(jī)理。表面張力減小的機(jī)理可以用于解釋表面活性劑對(duì)蛋白質(zhì)溶液凍結(jié)過(guò)程的保護(hù)。限制蛋白質(zhì)分子擴(kuò)散的機(jī)理認(rèn)為，許多保護(hù)劑都能夠提高溶液的粘度，抑制活性分子的擴(kuò)散。
　　
　　(二)干燥過(guò)程中的保護(hù)機(jī)理玻璃態(tài)假說(shuō)在含有保護(hù)劑溶液的干燥過(guò)程中，當(dāng)濃度足夠大且保護(hù)劑不發(fā)生結(jié)晶時(shí)，保護(hù)劑與活性組分混合物就會(huì)形成玻璃態(tài)。玻璃態(tài)分為兩種即：強(qiáng)玻璃和弱玻璃。在玻璃化轉(zhuǎn)變溫度以下進(jìn)行降溫，弱玻璃粘度的增加，比強(qiáng)玻璃來(lái)的快。因此，賦形劑形成弱玻璃要比形成強(qiáng)玻璃的保護(hù)效果好得多。蔗糖和海藻糖就是因?yàn)槟軌蛐纬梢环N弱玻璃而具有很好的保護(hù)作用。水替代假說(shuō)由于蛋白質(zhì)分子中存在大量的氫鍵，結(jié)合水通過(guò)氫鍵與蛋白質(zhì)分子連接。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)在冷凍干燥過(guò)程中推動(dòng)水分后，保護(hù)劑的羥基能夠替代蛋白質(zhì)表面上水的羥基，使蛋白質(zhì)表面形成一層“水合層”，這樣就可以保護(hù)氫鍵的聯(lián)結(jié)位置不直接暴露在周圍環(huán)境中，從而保持了蛋白質(zhì)天然結(jié)構(gòu)和功能的完整性。當(dāng)冷凍干燥時(shí)，保護(hù)劑可與生物大分子的失水部位形成氫鍵，替代保持生物大分子凍干損傷。
　　
　　(三)儲(chǔ)藏過(guò)程中的保護(hù)機(jī)理干燥過(guò)程中出現(xiàn)的引起蛋白質(zhì)變質(zhì)的時(shí)間尺度為小時(shí)，而對(duì)于儲(chǔ)藏而言，時(shí)間尺度為月或年。在正確的冷凍干燥工藝中，要求產(chǎn)品溫度接近于其玻璃化轉(zhuǎn)變溫度，而在正確的儲(chǔ)藏條件下，環(huán)境溫度應(yīng)當(dāng)比其玻璃化轉(zhuǎn)變溫度低得多，以獲得很長(zhǎng)的松馳時(shí)間。
　　
　　三、耐熱凍干保護(hù)劑配方需要注意的問(wèn)題
　　
　　確定*的pH值生物制品中的活性成分（如蛋白質(zhì)）只有在很小的PH值范圍內(nèi)才是穩(wěn)定的，并且不同的PH環(huán)境會(huì)影響蛋白質(zhì)的溶解性。*的PH環(huán)境有利于蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和它在溶液中的溶解性，冷凍干燥配方的PH對(duì)凍干生物制品長(zhǎng)期儲(chǔ)藏的穩(wěn)定性也會(huì)帶來(lái)很大影響。另外，酸堿度會(huì)影響固體狀態(tài)下蛋白質(zhì)的物理和化學(xué)的穩(wěn)定性。緩沖劑的選擇許多緩沖劑能夠用于生物制品耐熱保護(hù)劑配方中，但是并非每一種緩沖劑都能夠用于任何溶液；對(duì)PH值敏感的蛋白質(zhì)溶液，就應(yīng)當(dāng)避免使用磷酸鈉緩沖液，這是由于在凍結(jié)過(guò)程中，Na2HPO4易于優(yōu)先結(jié)晶，使得溶液的PH降低，zui終引起蛋白質(zhì)變性；正確選擇緩沖劑的濃度也是很重要的。填充劑的選擇填充劑有相當(dāng)好的溶解性，與生物制品中活性組分相容，沒(méi)有或者只有很小的毒性，具有較高的共晶溫度。低溫、干燥保護(hù)劑的選擇糖類是生物制品冷凍干燥過(guò)程中使用zui頻繁的保護(hù)劑，一般不選用還原性糖，因?yàn)樗赡芘c蛋白質(zhì)之間發(fā)生非酶褐變反應(yīng)；某些鹽類也要用作生物制品在冷凍干燥過(guò)程中的保護(hù)劑；某些聚合物，因其能提高玻璃化轉(zhuǎn)變溫度，而常被用作保護(hù)劑。但是，聚合物與蛋白質(zhì)分子形成氫鍵的能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于糖類，所以常常采用聚合物和糖聯(lián)合使用，當(dāng)然，這種方式并不是對(duì)每一種蛋白質(zhì)都是有效的。本研究采用上海億倍中試機(jī)型YB-FD-50L進(jìn)行凍干保護(hù)劑效果驗(yàn)證。上海億倍YB-FD-50L機(jī)型可實(shí)現(xiàn)預(yù)凍多階段控制，預(yù)凍溫度可調(diào)可控；升華階段及解析階段可按工藝要求進(jìn)行制品溫度，箱內(nèi)真空度及升溫速率控制。驗(yàn)證過(guò)程中證實(shí)預(yù)凍過(guò)程中凍干保護(hù)劑達(dá)到需求效果關(guān)聯(lián)因素有：凍干設(shè)備性能（凍干機(jī)隔板均一性，降溫速率大小及傳熱性能等）；凍干工藝是否擬合凍干保護(hù)劑性能；凍干保護(hù)劑濃度是否正確。